Digital and multiplex detection of microRNAs for molecular diagnostics
Détection digitale et multiplexe de microARN pour le diagnostic moléculaire
Résumé
MicroRNAs are short, non-coding, single-stranded RNA molecules involved in post-transcriptional regulation of protein expression. A plethora of studies reported that the concentrations of some miRNAs are dysregulated in numerous pathological conditions, such as cancers, cardiovascular or Alzheimer's diseases, making them potential markers of these diseases. Additionally, the miRNAs released in bodily fluids are protected by protein complexes, which improves their stability in these fluids. For those reasons, miRNAs appear as promising targets for the development of new diagnostic methods. MiRNA-based diagnostics however require high levels of sensitivity, specificity and quantitativity. Additionally, the potential of miRNAs as biomarkers most likely lies in the parallelized analysis of several miRNAs, forming a profile of the patient, which is then compared to pathological and non-pathological miRNA signatures. The ability to detect several miRNAs simultaneously is therefore of prime importance. In this PhD thesis, we report on the development of a high-multiplex and digital miRNA detection method. The technique combines a chemical network allowing exponential amplification of a molecular signal and droplet microfluidics. The developed method allows the absolute quantification of up to 20 miRNAs, outperforming the gold-standard method for miRNA detection, RT-qPCR. The sensitivity of the method is suited for miRNA detection from bodily fluids, with a limit of detection in the femtomolar range.
Les microARN sont de courts ARN simple brins, non codants, impliqués dans la régulation post transcriptionnelle de l'expression génétique. De nombreuses études ont montré que les concentrations de miARN dans les fluides corporels sont dérégulées dans de nombreuses conditions pathologiques, comme les cancers, les maladies cardiovasculaires ou bien encore la maladie d'Alzheimer, en faisant de potentiels indicateurs de ces maladies. De plus, les miARN sont libérés dans les fluides corporels, notamment le sang, sous la forme de complexes protéiques, ce qui leur confère une meilleure stabilité, en comparaison d'autres marqueurs circulants, dans ces fluides. Pour ces raisons, les miARN apparaissent comme des cibles de choix pour le développement de nouvelles méthodes de diagnostic. Ces méthodes requièrent cependant de hauts niveaux de sensibilité, de spécificité et de quantitativité, qui sont autant de défis technologiques. De plus, le potentiel diagnostique des miARN se situe probablement dans l'analyse chez le patient de différents miARN, formant un profil pouvant être comparé avec les signatures miARN typiques des conditions pathologiques ou non-pathologiques. Ainsi, la capacité de quantifier différents miARN en parallèle est également cruciale. Dans cette thèse, nous présentons les différentes étapes du développement d'une méthode permettant la quantification absolue et multiplexe de miARN. Cette méthode combine l'utilisation d'un réseau de réactions chimiques permettant l'amplification exponentielle d'un signal moléculaire avec la production de microémulsions par microfluidique. La technique développée permet la quantification de 20 miARNs simultanément, une capacité bien supérieure à celle de la RT-qPCR, méthode standard pour la détection de miARN. La sensibilité de notre méthode est adaptée pour l'analyse de miARN dans les fluides corporels humains, avec une limite de détection de l'ordre du femtomolaire.
Origine : Version validée par le jury (STAR)